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生物合成過程的標記

基本原理
 
對生物合成過程進行標記,主要是為了研究蛋白質的生化性質、合成、加工、細胞內傳送、分泌和降解過程。通常將細胞放在含有充足營養成分和放射性標記氨基酸的培養基中,雖然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白質中的含量較低,但其35S標記物具有特異性高(>2.93 ×1013 Bq/mmol) 、容易檢測的特點,因此是進行生物合成標記的首選氨基酸。下列步驟是對懸浮液中細胞(脾或胸腺的單細胞懸浮液或者培養物)進行短期標記的方法。
 
 注意事項:
實驗室應具備進行放射性化合物操作的各種相關設備。
1. 放射性工作專用的水浴槽,保溫箱和離心機;
2. 在進行標記操作的時候,用蓋革氏計數器監測操作區域;
3. 做好35S 固體與液體廢物的處理工作;
4. 在實驗開始之前,要得到相關部門的批準;操作中,要嚴格地遵照國家管理條例的要求。
 
試劑與設備
 
l         在培養基中的細胞
l         冰冷卻的 PBS (參見附錄 A)
l         標記培養基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640 培養基,水浴預熱到 37 ℃
l         [35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸(800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 ×1013 Bq/mmol)
l         15或 50 ml 錐形聚丙烯離心管
l         對標記培養基充分透析的胎牛血清(FCS)
l         L-谷氨酸.
l         微量吸管
l         恒溫箱
l         離心機 (冷凍)
 
操作步驟
 
(一) 細胞的準備工作
1.       在室溫下, 以300 ×g 離心5 分鐘,收集到 107-108 個細胞;
2.       在錐形離心管中,用10ml 37 ℃的標記培養基洗滌細胞,然后300 × g 離心5 分鐘;
3.       丟棄上層清液;
4.       細胞沈淀加入標記培養基,重復洗滌一次。
 
(二) 前脈沖Prepulse
1.       洗滌后的細胞, 用37 ℃預熱的標記培養基重新懸浮 (4 ml含 20 ×106個細胞) ,在37 ℃孵育 30分鐘,間歇漩渦振蕩,以耗盡細胞內原有的蛋氨酸和半胱氨酸;
2.       室溫解凍[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸;
3.       注意: [35S] 蛋氨酸容易揮發,請在專用的、裝有活性炭過濾器的通風櫥內,打開[35S] 蛋氨酸儲存液。目前,不易揮發的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸均有商品出售。
4.       細胞液在室溫下, 以300 × g 離心5 分鐘,棄上清。
 
(三) 脈沖Pulse
1.       將細胞團重新懸浮于標記培養基中 (濃度20 ×106個細胞/1 ml) ;
2.       加入 250 μCi 的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸 (9.25 ×109 Bq);
3.       細胞放入37 ℃恒溫箱中,孵育30 分鐘到 3 小時,孵育期間經常振蕩,以保持細胞懸浮;
4.       細胞液在室溫下, 以300 ×g 離心5 分鐘,棄上清;
5.       警告: 使用過的培養基和洗滌液均含有放射性,因此,請按規定方法操作和處理放射性物質;
6.       用10ml 冰冷的 PBS 重新懸浮細胞,反復洗滌兩次;
7.       按“細胞提取液的制備”(見Protocol 43)中的方法進行細胞處理和分析,或者-20 ℃凍存細胞。
 
 
質量要點
 
1.       如果脈沖需要持續1小時以上,需要在無菌的條件下,向標記培養基中添加2% 的胎牛血清和2%的 L-谷氨酸;
2.       對于大多數類型的細胞,可以采用帶螺口的組織培養瓶,并在濕潤的、含5% CO2的培養箱中進行孵育;
3.       孵育必須在37 ℃進行,溫度低會顯著地減少摻入到蛋白質中的放射性;
4.       也可以使用14C-標記的氨基酸作標記,其半衰期長,有利于在較長的時間(幾個星期)內使用標記的蛋白質,  例如標記雜交瘤B細胞分泌的單克隆抗體,就常采用14C-標記的氨基酸混合物(絲氨酸,亮氨酸,纈氨酸)。

0512-62512025

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