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鄰位連接技術簡介

如何提高蛋白質檢測的特異性和靈敏度是我們一直不斷探索的問題,在現已找到的各種答案中,鄰位連接技術(proximity ligation assay,PLA)是最令人滿意的解決方案之一。與常用的其它蛋白質檢測方法相比,PLA 在兼備高特異性和高靈敏度的同時還具有快速靈活和高通量、多功能等優點。除在蛋白質檢測方面的應用外,PLA 還可用于檢測各種生物樣本(包括亞細胞結構、細胞和組織)和研究大分子間的相互作用(包括蛋白質- 蛋白質相互作用和DNA-蛋白質相互作用)。該技術在從建立到現在的短短十年內取得了飛速發展,并正逐步被應用于醫學和生物學等眾多領域。

 

1  PLA 的基本原理

PLA技術吸取了適體技術、連接酶技術和Taqman 探針技術的精華,并糅合了ELISA、滾環復制的一些核心理念。該技術的基本原理是:一對鄰位探針通過其適體部分與被測蛋白特異性結合,接著這對鄰位探針通過其輔助核酸序列與同一條連接探針互補結合,然后連接酶以連接探針為模板將兩條鄰位探針的輔助核酸序列連接起來,從而形成一條完整的單鏈。加入引物、Taqman 探針和Taq 酶后,上游引物以此條完整單鏈為模板合成互補鏈,形成DNA 雙鏈;之后便是一個完整的Taqman 探針實時PCR 過程,最后通過檢測熒光信號便可知道被測蛋白的存在及其含量。

    

      2 PLA 的主要類型

    從不同的分類角度出發,PLA 可分為多種不同的類型。依照反應過程中是否需要分離未結合的鄰位探針,可將PLA分為均相、固相和原位3 種類型。均相PLA 不需要進行洗脫來去除多余的鄰位探針,而固相PLA 和原位PLA 均需要進行洗脫;此外,原位PLA 采用滾環復制,可實現蛋白的原位檢測。根據鄰位探針的類型可將PLA 分為適體PLA 和抗體PLA,適體PLA 采用適體來特異性結合被測蛋白,而抗體PLA 則通過抗體和被測蛋白抗原進行特異結合。從同時可檢測的蛋白質種類來看,PLA 最初一次僅能檢測一種蛋白質,接著發展到可同時檢測數種蛋白質,而目前通過與芯片技術結合,已能夠同時對數百種甚至上千種蛋白質進行檢測。

     

         3 PLA 的突出特點

        PLA 具有特異、靈敏、快速、靈活、高通量和多功能等特點,但與當前常用的蛋白質檢測技術相比,其最突出的特點是特異性和靈敏度的完美結合。ELISA 方法檢測蛋白質具有較好的特異性和靈敏度,但與PLA 相比,其靈敏度相差甚遠。PLA 能夠在1微升樣品中檢測出fmol 級的蛋白質分子,其靈敏度為ELISA 的1000 倍。而與免疫PCR 相比,PLA 的靈敏度與其相當,但特異性卻顯著優于前者。因此,PLA 不但擁有非常好的靈敏度,而且具備很好的特異性,從而展現出了其它方法難以企及的應用前景。

 

PLA技術的應用

 

        1. 應用PLA 檢測細胞因子、酶和受體

    到目前為止,可應用PLA 檢測的細胞因子包括PDGF、VEGF、EGF、TNF-α、IGF-2、IL-1α、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10 等等[5~7],可檢測的酶包括凝血酶、組織蛋白酶、羧肽酶、整合素樣金屬蛋白酶8 等。此外,應用原位PLA 檢測各種受體也相繼被報道,例如檢測PDGF 受體、EGF 受體等

 

        2. 應用PLA 檢測腫瘤標志物

    現已發現的各類腫瘤標志物中,蛋白質是較為常見的一類,因而PLA 在檢測腫瘤標志物方面也能夠發揮作用。當前可應用PLA 進行標志物檢測的腫瘤主要有胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。這些腫瘤標志物的PLA 檢測均采用抗體結合形式,其靈敏度明顯高于現有的ELISA 方法和化學發光法。

 

        3. 應用PLA 檢測病原體

    各種病原體諸如細菌、病毒等,其表面均有種屬特異性蛋白,通過針對這些蛋白的單克隆抗體構建鄰位探針,從而建立特異檢測某種病原體的PLA 試驗方法。與DNA 檢測方法比較,由于單個病原體細胞(或非細胞結構)的表面蛋白數量眾多,而其基因組DNA 卻為單個拷貝,所以PLA 的模板量較DNA檢測的模板數要多,從而具有更高的靈敏度。另外,PLA 檢測病原體不需要提取DNA,可直接采用血清進行檢測。

 

       4. 應用PLA 檢測DNA- 蛋白質間相互作用

        Gustafsdottir 等對經典的PLA 加以改造,建立了可檢測DNA- 蛋白質間相互作用的PLA 方法。其實現方式是:首先在目的DNA 片段尾端加上輔助序列構建一條特殊的鄰位探針,然后以抗目的蛋白質的單克隆抗體為基礎構建另一條抗體型鄰位探針;如果蛋白質能與DNA 片段相互結合,兩條鄰位探針就能靠近并共同結合在連接探針上,繼而實現連接并產生陽性結果。與ChIP 技術相比,PLA 在檢測P53、HNF-4α 和USF1 與DNA之間相互作用時更具優勢,如操作簡便、成本較低和假性結合率低等。

 

       5. DNA 甲基化的監測

       Cartron 等通過應用PLA檢測DNA 甲基化酶I(DnmtI)與PCNA 間的相互作用,發現二者的結合程度與DNA 甲基化程度存在正相關關系,從而為監測細胞整體DNA 甲基化提供了新的方法。

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