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抗體的熒光標記法

基本原理
 
許多蛋白質分子在其表面含有較多的賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基的游離ε-氨基可與FITC(其激發波長為492nm, 發射光波長為525nm)共價結合。與FITC結合的抗體可用為特異性的探針,以測定細胞相應抗原的存在。FITC具有很高的量子產量(發射光與吸收光的比值,0 .85),而且形成的偶聯物的穩定性很好。FITC是應用最廣的熒光染料,流式細胞儀就按FITC的特性,設計了激光波長為488 nm,很接近于FITC的最大激發波長492nm)。
偶聯反應是在pH 9.8條件下,賴氨酸殘基的游離ε-氨基與FITC發生的親核反應,由此形成硫脲連接。
 
試劑及儀器
 
l         待偶聯抗體
l         碳酸氫鈉緩沖液:25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3緩沖液pH9.8 (新鮮配制,配法見附錄)
l         PBS (見附錄)
l         疊氮鈉(有毒試劑)
l         異硫氰酸熒光素(I型異購體,有商品供應)
l         電磁攪拌器
l         鋁鉑
 
操作步驟
 
1. 用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋抗體為1-5mg/ml,或抗體對該緩沖液充分透析,以足以使賴氨酸不解離(去其正電荷),但注意保持大部分蛋白質仍未變性;
2. 將透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中,用鋁鉑包燒杯以避光,4℃攪拌過夜;
3. 上述抗體液對PBS在4℃透析以終止反應。其間至少更換PBS液三次,直致480nm 的吸收為零;
4. 加入0.5g/L 的疊氮鈉。此后,結合物在4℃避光保存,或分裝后在-20℃凍存。
 
熒光偶聯質量的檢測
 
用標準免疫熒光染色試驗以測定偶聯率。
或用F/P值測定對其FITC標記質量進行鑒定:
取結合物液0.2ml,加PBS 2.8ml(或兩者均改用半量),測定其A490/A280,查 FITC標志曲線得其濃度μg/ml值,按IgG的消光系數(mg/ml約A280 1.2),可計算其F/P值,即每mg抗體所標記的μgFITC的比值,可以此鑒定及比較各批標記物的質量。
 
實驗要點及說明
 
1.  偶聯反應要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進行,而且注意在反應過程中要保持此pH水平;
2.  要確定在偶聯反應緩沖液中不含游離氨基(Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應,因此會降低蛋白質與FITC的偶聯率);
3.  FITC與蛋白質的比值(F/P),可通過測定495nm與280nm吸光度來鑒定。此比值的范圍應為0.3-1.0(方法見前);
4.  FITC唯一的缺限是易被光淬滅,因此復合物必須始終避光保存;
5.  如果FITC-復合物對PBS透析不充分,可能造成高本底,對免疫熒光染色產生干擾;
6.  如果被標記的蛋白質是第二抗體或通用的第一抗體,則從商品購置可能更方便可取。

0512-62512025

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